V molekulárnej biológii môže byť dobrým výberom pufra a príprava na rôzne kroky izolácie DNA rozdiel medzi prechodom na expresiu proteínu alebo otvorením inej súpravy maxi-prep na začiatok. Aj napriek ich rozhodujúcemu významu sú receptúry na vyrovnávacie pamäti často len tie recepty napísané bez vysvetlenia alebo zdôvodnenia pre jednotlivé komponenty. Jedným takýmto pufrom je glukóza-tris-EDTA alebo GTE pufor.
$config[code] not foundNa čo sa používa GTE?
GTE sa používa na resuspendovanie peliet bakteriálnych buniek pred lýzou (roztrhnutím) buniek a zberom DNA plazmidu vnútri. Lyzozým, ktorý zmäkčuje bunkové membrány, sa často pridáva spolu s pufrom GTE. Dosiahnutie homogénnej suspenzie celých buniek počas tohto kroku tak, aby sa následne pridaný lyzačný roztok mohol dostať do všetkých buniek, je kľúčom k získaniu dobrých výťažkov DNA. GTE je navrhnuté tak, aby poskytovalo stabilné prostredie pre DNA.
Glukóza pre osmolaritu
Na GTE pufor sa pridá 50mM (milimolárny) glukózový cukor, aby sa zachovala osmolarita, pričom koncentrácia rozpustenej látky mimo buniek je blízka koncentrácii vnútri buniek. Tým sa zabráni predčasnej lýze buniek, čo môže v dôsledku agregácie a degradácie spôsobiť nižšie výnosy DNA. Ostatné zložky tlmivého roztoku tiež prispievajú k osmolarite roztoku, avšak glukóza, ktorá je neelektrolytom, je dobrou voľbou, pretože nezasahuje do pufrových vlastností roztoku.
Tris pre stabilitu pH
Tris je krátky názov pre tris (hydroxymetyl) aminometán, čo je veľmi bežný pH pufor. V prípade pufru GTE sa k pufru pridáva kyslá soľ (Tris-HCl) v koncentrácii 25 mM. Toto udržiava pH roztoku pri blízkej fyziologickej hodnote 8,0, čo je ideálne pH na prevenciu kyslej hydrolýzy (degradácie) plazmidovej DNA a nechcených vedľajších reakcií iných bunkových zložiek.
EDTA zabraňuje degradácii DNA
EDTA alebo kyselina etyléndiamíntetraoctová zachytávajú alebo "chelátujú" kovové ióny z roztoku, čím zabraňujú účasti na nežiaducich vedľajších reakciách. V pufri GTE sa pridá EDTA pri 10 mM. Jeho primárnym účelom je v pufri zaokrúhliť voľný zinok, horčík a vápnik, čím sa zabráni degradácii DNA určitými cestami, ktoré vyžadujú tieto kovy.
Niektoré dôležité tipy
Udržujte GTE pufor v chlade a urobte ho v malom množstve, aby ste zabránili rastu neplánovaných baktérií v ňom. Cukor a kontrolované pH vytvárajú veľké rastové médium. Vždy používajte čistenú vodu. Voda z vodovodu môže mať z rúrok prebytok iónov kovov, čo môže prekonať schopnosť EDTA zachytiť. Ak máte podozrenie na prítomnosť interferujúcej RNA vo vzorke, pridajte RNázu A na 100 mikrogramov na mililiter do vyrovnávacej pamäte GTE, aby ste odstránili problém.
